O que é CRISPR?

A tecnologia CRISPR é uma ferramenta simples, mas poderosa, para editar genomas. Ele permite que os pesquisadores alterem facilmente as sequências de DNA e modifiquem a função do gene. Suas muitas aplicações potenciais incluem correção de defeitos genéticos, tratamento e prevenção da propagação de doenças e melhoria de safras. No entanto, sua promessa também levanta questões éticas.

No uso popular, "CRISPR" (pronuncia-se "mais nítido") é a abreviação de "CRISPR-Cas9." CRISPRs são extensões especializadas de DNA. A proteína Cas9 (ou "associada a CRISPR") é uma enzima que atua como uma tesoura molecular, capaz de cortar fitas de DNA.

A tecnologia CRISPR foi adaptada dos mecanismos naturais de defesa de bactérias e arqueas (o domínio dos microrganismos unicelulares). Esses organismos usam RNA derivado de CRISPR e várias proteínas Cas, incluindo Cas9, para impedir ataques de vírus e outros corpos estranhos. Eles fazem isso principalmente cortando e destruindo o DNA de um invasor estrangeiro. Quando esses componentes são transferidos para outros organismos mais complexos, isso permite a manipulação de genes, ou "edição".

Até 2017, ninguém sabia realmente como era esse processo. Em um artigo publicado em 10 de novembro de 2017 na revista Nature Communications, uma equipe de pesquisadores liderada por Mikihiro Shibata da Universidade de Kanazawa e Hiroshi Nishimasu da Universidade de Tóquio mostrou como é quando um CRISPR está em ação pela primeira vez Tempo. [Um novo GIF de tirar o fôlego mostra CRISPR mastigando DNA]

CRISPR-Cas9: Os principais jogadores

CRISPRs: "CRISPR "significa" grupos de repetições palindrômicas curtas regularmente espaçadas ". É uma região especializada do DNA com duas características distintas: a presença de repetições de nucleotídeos e espaçadores. Sequências repetidas de nucleotídeos - os blocos de construção do DNA - são distribuídas por um CRISPR região. Os espaçadores são pedaços de DNA intercalados entre essas sequências repetidas.

No caso das bactérias, os espaçadores são retirados de vírus que anteriormente atacavam o organismo. Eles servem como um banco de memórias, que permite às bactérias reconhecer os vírus e combater ataques futuros.

Isso foi demonstrado pela primeira vez experimentalmente por Rodolphe Barrangou e uma equipe de pesquisadores da Danisco, uma empresa de ingredientes alimentícios. Em um artigo de 2007 publicado na revista Science, os pesquisadores usaram Streptococcus thermophilus bactérias, que são comumente encontradas em iogurtes e outras culturas de laticínios, como seu modelo. Eles observaram que, após um ataque de vírus, novos espaçadores foram incorporados à região CRISPR. Além disso, a sequência de DNA desses espaçadores era idêntica às partes do genoma do vírus. Eles também manipularam os espaçadores removendo-os ou inserindo novas sequências de DNA viral. Dessa forma, eles conseguiram alterar a resistência da bactéria ao ataque de um vírus específico. Assim, os pesquisadores confirmaram que os CRISPRs desempenham um papel na regulação da imunidade bacteriana.

RNA CRISPR (crRNA): Assim que um espaçador é incorporado e o vírus ataca novamente, uma parte do CRISPR é transcrita e processada em RNA CRISPR, ou "crRNA". A sequência de nucleotídeos do CRISPR atua como um molde para produzir uma sequência complementar de RNA de fita simples. Cada crRNA consiste em uma repetição de nucleotídeo e uma porção espaçadora, de acordo com uma revisão de 2014 por Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier, publicada na revista Science.

Cas9: A proteína Cas9 é uma enzima que corta DNA estranho.

A proteína normalmente se liga a duas moléculas de RNA: crRNA e outra chamada tracrRNA (ou "crRNA transativador"). Os dois então guiam Cas9 para o local de destino onde fará o corte. Esta extensão de DNA é complementar a um trecho de 20 nucleotídeos do crRNA.

Usando duas regiões separadas, ou "domínios" em sua estrutura, Cas9 corta ambas as fitas da dupla hélice de DNA, fazendo o que é conhecido como "quebra de fita dupla", de acordo com o artigo da Science de 2014.

Há um mecanismo de segurança integrado, que garante que o Cas9 não corte em qualquer lugar do genoma. Sequências curtas de DNA conhecidas como PAMs ("protospacer adjacentes motifs") servem como marcadores e ficam adjacentes à sequência de DNA alvo. Se o complexo Cas9 não vir um PAM próximo a sua sequência de DNA alvo, ele não cortará. Esta é uma possível razão pela qual Cas9 nunca ataca a região CRISPR em bactérias, de acordo com uma revisão de 2014 publicada na Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 como ferramenta de edição de genoma

Os genomas de vários organismos codificam uma série de mensagens e instruções em suas sequências de DNA. A edição do genoma envolve a alteração dessas sequências, alterando assim as mensagens. Isso pode ser feito inserindo um corte ou quebra no DNA e enganando os mecanismos naturais de reparo do DNA de uma célula para introduzir as mudanças desejadas. CRISPR-Cas9 fornece um meio para fazer isso.

Em 2012, dois artigos de pesquisa essenciais foram publicados nas revistas Science e PNAS, que ajudaram a transformar o CRISPR-Cas9 bacteriano em uma ferramenta simples de edição de genoma programável.

Os estudos, conduzidos por grupos separados, concluíram que Cas9 poderia ser direcionado para cortar qualquer região do DNA. Isso poderia ser feito simplesmente mudando a sequência de nucleotídeos do crRNA, que se liga a um DNA complementar alvo. No artigo da Science de 2012, Martin Jinek e colegas simplificaram ainda mais o sistema, fundindo crRNA e tracrRNA para criar um único "RNA guia". Assim, a edição do genoma requer apenas dois componentes: um RNA guia e a proteína Cas9.

"Operacionalmente, você projeta um trecho de 20 pares de bases [de nucleotídeos] que correspondem a um gene que você deseja editar", disse George Church, professor de genética na Harvard Medical School. Uma molécula de RNA complementar a esses 20 pares de bases é construída. Church enfatizou a importância de garantir que a sequência de nucleotídeos seja encontrada apenas no gene alvo e em nenhum outro lugar do genoma. "Então, o RNA mais a proteína [Cas9] cortará - como uma tesoura - o DNA naquele local e, idealmente, em nenhum outro lugar", explicou ele.

Assim que o DNA é cortado, os mecanismos naturais de reparo da célula entram em ação e trabalham para introduzir mutações ou outras mudanças no genoma. Isso pode acontecer de duas maneiras. De acordo com o Huntington's Outreach Project em Stanford (University), um método de reparo envolve colar os dois cortes novamente. Este método, conhecido como "união de extremidades não homólogas", tende a introduzir erros. Os nucleotídeos são inseridos ou deletados acidentalmente, resultando em mutações que podem interromper um gene. No segundo método, a quebra é corrigida pelo preenchimento da lacuna com uma sequência de nucleotídeos. Para fazer isso, a célula usa uma fita curta de DNA como molde. Os cientistas podem fornecer o modelo de DNA de sua escolha, escrevendo assim qualquer gene que desejarem ou corrigindo uma mutação.

Utilidade e limitações

CRISPR-Cas9 se tornou popular nos últimos anos. Church observa que a tecnologia é fácil de usar e cerca de quatro vezes mais eficiente do que a melhor ferramenta de edição de genoma anterior (chamada TALENS).

Em 2013, os primeiros relatórios do uso de CRISPR-Cas9 para editar células humanas em um ambiente experimental foram publicados por pesquisadores dos laboratórios de Church e Feng Zhang do Broad Institute do Massachusetts Institute of Technology e Harvard. Estudos utilizando modelos in vitro (de laboratório) e animais de doenças humanas demonstraram que a tecnologia pode ser eficaz na correção de defeitos genéticos. Exemplos de tais doenças incluem fibrose cística, catarata e anemia de Fanconi, de acordo com um artigo de revisão de 2016 publicado na revista Nature Biotechnology. Esses estudos abrem caminho para aplicações terapêuticas em humanos.

"Acho que a percepção pública do CRISPR está muito focada na ideia de usar a edição de genes clinicamente para curar doenças", disse Neville Sanjana, do New York Genome Center e professor assistente de biologia, neurociência e fisiologia da New York University. "Esta é sem dúvida uma possibilidade excitante, mas esta é apenas uma pequena parte."

A tecnologia CRISPR também foi aplicada nas indústrias de alimentos e agrícolas para criar culturas probióticas e vacinar culturas industriais (para iogurte, por exemplo) contra vírus. Também está sendo usado em lavouras para melhorar o rendimento, a tolerância à seca e as propriedades nutricionais.

Uma outra aplicação potencial é a criação de unidades genéticas. Esses são sistemas genéticos, que aumentam as chances de uma determinada característica ser transmitida de pais para filhos. Eventualmente, ao longo das gerações, a característica se espalha por populações inteiras, de acordo com o Instituto Wyss. Os impulsos genéticos podem ajudar a controlar a propagação de doenças como a malária, aumentando a esterilidade entre o vetor da doença - feminino Anopheles gambiae mosquitos - de acordo com o artigo 2016 da Nature Biotechnology. Além disso, as unidades de gene também podem ser usadas para erradicar espécies invasivas e reverter a resistência a pesticidas e herbicidas, de acordo com um artigo de 2014 de Kenneth Oye e colegas, publicado na revista Science.

No entanto, CRISPR-Cas9 tem suas desvantagens.

“Acho que a maior limitação do CRISPR é que ele não é cem por cento eficiente”, disse Church. Além disso, as eficiências de edição do genoma podem variar. De acordo com o artigo de 2014 da Science por Doudna e Charpentier, em um estudo realizado em arroz, a edição de genes ocorreu em quase 50 por cento das células que receberam o complexo Cas9-RNA. Considerando que, outras análises mostraram que, dependendo do alvo, a eficiência de edição pode chegar a 80 por cento ou mais.

Há também o fenômeno dos "efeitos fora do alvo", em que o DNA é cortado em locais diferentes do alvo pretendido. Isso pode levar à introdução de mutações indesejadas. Além disso, Church observou que mesmo quando o sistema corta no alvo, há uma chance de não obter uma edição precisa. Ele chamou isso de "vandalismo do genoma".

Definindo limites

As muitas aplicações potenciais da tecnologia CRISPR levantam questões sobre os méritos éticos e as consequências da adulteração de genomas.

No artigo da Science de 2014, Oye e colegas apontam para o potencial impacto ecológico do uso de drives genéticos. Uma característica introduzida pode se espalhar além da população-alvo para outros organismos por meio do cruzamento. Os impulsos genéticos também podem reduzir a diversidade genética da população-alvo.

Fazer modificações genéticas em embriões humanos e células reprodutivas, como espermatozoides e óvulos, é conhecido como edição da linha germinativa. Como as alterações nessas células podem ser transmitidas às gerações subsequentes, o uso da tecnologia CRISPR para fazer edições na linha germinativa levantou uma série de questões éticas.

Eficácia variável, efeitos fora do alvo e edições imprecisas representam riscos de segurança. Além disso, há muitas coisas ainda desconhecidas da comunidade científica. Em um artigo de 2015 publicado na Science, David Baltimore e um grupo de cientistas, especialistas em ética e jurídicos observam que a edição da linha germinativa aumenta a possibilidade de consequências indesejadas para as gerações futuras "porque há limites para o nosso conhecimento da genética humana, interações gene-ambiente, e os caminhos da doença (incluindo a interação entre uma doença e outras condições ou doenças no mesmo paciente). "

Outras preocupações éticas são mais matizadas. Devemos fazer mudanças que possam afetar fundamentalmente as gerações futuras sem o seu consentimento? E se o uso da edição de linha germinativa deixar de ser uma ferramenta terapêutica para se tornar uma ferramenta de aprimoramento para várias características humanas?

Para resolver essas preocupações, as Academias Nacionais de Ciências, Engenharia e Medicina elaboraram um relatório abrangente com diretrizes e recomendações para a edição do genoma.

Embora as Academias Nacionais recomendem cautela na busca da edição da linha germinativa, elas enfatizam que "cautela não significa proibição". Eles recomendam que a edição da linha germinativa seja feita apenas em genes que levam a doenças graves e somente quando não há outras alternativas de tratamento razoáveis. Entre outros critérios, eles enfatizam a necessidade de ter dados sobre os riscos e benefícios para a saúde e a necessidade de supervisão contínua durante os ensaios clínicos. Eles também recomendam o acompanhamento das famílias por várias gerações.

Pesquisa recente

Houve muitos projetos de pesquisa recentes baseados em CRISPR. "O ritmo das descobertas da pesquisa básica explodiu, graças ao CRISPR", disse o bioquímico e especialista em CRISPR Sam Sternberg, líder do grupo de desenvolvimento de tecnologia da Caribou Biosciences Inc., com sede em Berkeley, Califórnia, que está desenvolvendo soluções para medicina com base no CRISPR. agricultura e pesquisa biológica.

Aqui estão algumas das descobertas mais recentes:

• Em abril de 2017, uma equipe de pesquisadores divulgou uma pesquisa na revista Science em que haviam programado uma molécula CRISPR para encontrar cepas de vírus, como o Zika, no soro sanguíneo, urina e saliva.
• Em 2 de agosto de 2017, os cientistas revelaram na revista Nature que removeram um defeito cardíaco em um embrião com sucesso usando o CRISPR.
• Em 2 de janeiro de 2018, os pesquisadores anunciaram que podem ser capazes de parar fungos e outros problemas que ameaçam a produção de chocolate usando CRISPR para tornar as plantas mais resistentes a doenças.
• Em 16 de abril de 2018, os pesquisadores atualizaram o CRISPR para editar milhares de genes de uma vez, de acordo com pesquisa publicada pela revista BioNews.

Reportagem adicional de Alina Bradford, colaboradora.

Recursos adicionais

• Broad Institute: uma linha do tempo do trabalho fundamental no CRISPR
• Notícias sobre engenharia genética e biotecnologia: CRISPR-Cas9 aprimorado em 10000 vezes por meio de nucleotídeos sintéticos
• Instituto amplo: perguntas e respostas sobre CRISPR